自然殺傷(NK)細胞是一類獨特的天然淋巴樣細胞，具有識別和清除病毒感染細胞和腫瘤細胞的固有能力。NK細胞具有多種細胞毒機制和通過細胞因子的產(chǎn)生調(diào)節(jié)免疫反應的能力，在抗癌免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來，隨著嵌合抗原受體(CAR)工程的過繼T細胞療法的成功，以及將細胞轉(zhuǎn)化為強大的抗腫瘤武器的技術(shù)進步，人們對NK細胞作為免疫治療候選細胞的興趣呈指數(shù)級增長。在臨床上，第一代NK細胞療法取得了令人振奮的結(jié)果，顯示出了強大的療效和顯著的安全性，從而推動了繼續(xù)創(chuàng)新的巨大熱情。本文就增強NK細胞毒性和持久性的各種策略做一個簡單介紹，以指導如何設計下一代NK細胞產(chǎn)品。

01
CAR/TCR工程化NK細胞

嵌合抗原受體(CARs)是一種人工合成的融合蛋白，由胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號部分組成，可觸發(fā)細胞激活。CAR工程T細胞療法是第一個出現(xiàn)的，并開發(fā)了用于免疫腫瘤學應用的各種產(chǎn)品。自那以后，該領(lǐng)域迅速擴大，NK細胞也被整合到基因工程管道中。研究表明， CAR工程化NK細胞可以有效和特異性地靶向腫瘤，同時保持理想的安全性 (圖1) 。

圖1. CAR NK細胞示意圖

基于CAR的細胞治療的一個關(guān)鍵障礙是抗原逃逸，這是腫瘤通過抗原丟失或下調(diào)來逃避免疫反應的過程。已經(jīng)采取了各種戰(zhàn)略來解決這一問題。靶向多種抗原是一種可行的方法，既可以提高腫瘤檢測的嚴格性，又可以擴大治療效益(圖2)。這通常是通過表達兩個單獨的CAR(每個CAR針對腫瘤上的不同抗原并連接到兩個單獨的信號內(nèi)域)的雙順反子構(gòu)建體來實現(xiàn)的，或者通過表達包含雙特定識別結(jié)構(gòu)域的單個CAR來實現(xiàn)的，每個CAR串聯(lián)靶向不同的抗原并連接到單個信號內(nèi)域。

圖2.多抗原靶向CAR NK策略

還探索了改進CAR介導的激活控制的策略，特別是將靶上、腫瘤外效應所產(chǎn)生的毒性降至最低。已經(jīng)通過使用logic-gated CAR策略來促進選擇性靶向，被證明可以解決其中的一些問題。在這項工作中，研究小組通過二價CAR靶向AML細胞上的FLT3/CD33，并使用抑制性CAR將抗原結(jié)合到健康的造血干細胞(HSCs)上，并誘導出‘NOT signal’以防止細胞殺傷（圖3）。

圖3. logic-gated CAR策略

基于CAR的方法的另一個關(guān)鍵限制是，在大多數(shù)情況下，檢測能力僅限于表面蛋白質(zhì)。細胞內(nèi)抗原以多肽-人類白細胞抗原復合體的形式存在，通過TCR可以檢測到。改造NK細胞表達TCR可以檢測到這樣的多肽(圖4)。TCR引導的NK-92細胞最近被證明介導了成功的抗腫瘤反應。雖然需要更多的研究來驗證這種方法的臨床適用性，但一個潛在的優(yōu)勢是，因為NK細胞不具有內(nèi)源性TCR，因而不會出現(xiàn)錯配的問題。然而，缺點是NK細胞沒有配備T細胞中的完整信號機制，從而潛在地損害了通過合成TCR有效激活的能力。

圖4. TCR NK細胞示意圖

02
NK細胞銜接器

NK細胞也可以通過銜接器被引導到腫瘤部位，通過觸發(fā)NK細胞上的激活受體，同時將靶抗原結(jié)合到腫瘤細胞上，從而引發(fā)強大的NK細胞介導的抗腫瘤反應(圖5)。其他NK細胞銜接器策略包括三特異性和四特異性抗體設計，旨在通過靶向腫瘤上的多個抗原或通過交叉連接細胞因子部分來支持NK增殖和存活來增強抗腫瘤效果。NK 細胞銜接器的使用繞過了工程化，不需要載體介導的基因轉(zhuǎn)移，因此代表了一種更簡單、成本更低的制造工藝，但可以提供CAR-like活性。

圖5. NK 細胞銜接器示意圖

各種臨床前研究表明，當使用NK 細胞銜接器來靶向血液瘤和實體腫瘤時，展現(xiàn)了強大的抗腫瘤功效。例如，最近的研究表明，當通過使用靶向AML上的CLEC12A靶向腫瘤以及人源化的抗CD16單域抗體和IL-15激活NK細胞的三特異性NK 細胞銜接器，NK細胞對原發(fā)AML患者來源的AML體內(nèi)腫瘤模型具有強大抗腫瘤效應（圖6）。

圖6. CLEC12ATriKE體內(nèi)抗腫瘤效果

一些臨床試驗實驗的開展，需要評估這些NK細胞銜接器的抗腫瘤效果的持久性，并確定是否需要多種治療才能獲得持續(xù)的治療效果。

03
細胞因子武裝

雖然CAR和TCR工程技術(shù)尋求通過基因重定向其特異性來增強NK細胞的功能，但也有一些舉措旨在有效地在體外和體內(nèi)激活NK細胞，以維持最佳的抗腫瘤功能和持久性。眾所周知，新分離的NK細胞與已被激活的NK細胞相比，其殺細胞能力較低。解決這一限制的一種方法是細胞因子介導的激活。用IL-2、IL-15和IL-21組合的細胞因子體外擴增NK細胞增強了細胞毒功能、高增殖率，同時保持細胞處于健康、未耗竭的狀態(tài)。

現(xiàn)在已經(jīng)很清楚，當在IL-12/15/18存在的情況下培養(yǎng)時，PB-NK細胞可以轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N被稱為細胞因子誘導的記憶樣NK細胞的表型。在移植前和移植后的環(huán)境中，細胞因子誘導的記憶樣NK細胞在R/R復發(fā)性髓系腫瘤患者中都顯示出臨床療效。設計記憶樣NK細胞來表達CAR可以增強抗腫瘤反應，從而增強對抗NK耐藥腫瘤的效力。

盡管這些數(shù)據(jù)有力地表明了細胞因子激發(fā)的優(yōu)勢，但持續(xù)的體外刺激會使NK細胞“細胞因子成癮”，并導致在缺乏體內(nèi)細胞因子支持的情況下輸注這些細胞時其持久性降低。為了避免這個問題，同時仍然利用細胞因子激活的好處，通過基因工程，NK細胞被修飾以產(chǎn)生支持細胞潛能、增殖和持久性的細胞因子(圖7)。這種自分泌細胞因子極大的引起了研究人員的興趣，CAR工程化的NK細胞為了提高其持久性也采用了攜帶補充細胞因子信號的基因工程化策略。由工程NK細胞產(chǎn)生的細胞因子還可以介導旁觀者效應，從而激活存在于腫瘤微環(huán)境中的其他免疫效應細胞，如T細胞或髓系細胞，從而潛在地進一步增強抗腫瘤反應。

圖7. NK細胞細胞因子基因工程修飾

04
克服免疫抑制

TME由復雜和嚴酷的代謝環(huán)境組成，其特征是免疫抑制代謝物、葡萄糖和氨基酸缺乏、低氧和酸性的異質(zhì)混合。這些因素協(xié)同作用阻止了有效的抗腫瘤免疫。特別是在實體腫瘤中，缺氧是免疫細胞功能障礙的常見驅(qū)動因素。已有研究表明，缺氧性TME中NK細胞功能受損，部分原因是MDSCs、Treg和M2巨噬細胞在TME中的含量增加，以及缺氧對NK細胞功能的直接影響。據(jù)報道，抑制NK細胞中缺氧反應的HIF1a信號可以增強NK細胞的效力，并釋放NK細胞介導的抗腫瘤功能。

腫瘤往往表現(xiàn)出異常的代謝行為，導致乳酸水平升高、重要營養(yǎng)物質(zhì)枯竭以及有毒分解代謝物、腺苷和活性氧類濃度增加。為了克服代謝免疫抑制的有害影響，目前的策略主要集中在兩個領(lǐng)域：改變腫瘤的代謝構(gòu)成或修改免疫細胞中的基因表達程序，以保護它們免受TME中抑制代謝物的影響。當然我們試圖調(diào)節(jié)TME中的免疫代謝時，實現(xiàn)生理平衡是很重要的，因為一些代謝物是正常代謝的重要組成部分。目前許多策略仍在開發(fā)中，通過TME調(diào)節(jié)和NK細胞工程相結(jié)合的方法可能會進一步減少免疫抑制。

05
免疫檢查點調(diào)節(jié)

腫瘤已經(jīng)進化出復雜的機制來逃避免疫監(jiān)視，包括參與免疫檢查點，這可能會以與T細胞類似的方式抑制NK細胞。

抑制性KIR是NK細胞功能的強有力的負性調(diào)節(jié)因子，當與HLA class I類配體結(jié)合時，可以覆蓋任何伴隨的激活信號。由于其在抑制NK細胞功能中的重要作用，抑制性KIR引起了研究者與制藥公司的極大興趣。Lirilumab是一種panKIR2D抗體，通過阻斷這些抑制性KIRs，使NK細胞激活。然而，在兩個早期臨床試驗中，Lirilumab未能引起有臨床意義的應答。這些結(jié)果的一個潛在原因可能源于抑制性KIR在NK細胞教育和licensing的重要作用。在這一假設下，Lirilumab持續(xù)阻斷KIRs可能會對NK細胞功能產(chǎn)生負面影響。

與KIR分子類似， NKG2A是另一種重要的負性NK細胞調(diào)節(jié)因子，當與其同源配體HLAE結(jié)合時，可抑制NK細胞的細胞毒作用。Monalizumab破壞了這種相互作用，當與西妥昔單抗聯(lián)合使用時，在以前治療過的復發(fā)或轉(zhuǎn)移性頭頸部鱗狀細胞癌患者中產(chǎn)生了的31%的客觀應答率。Monalizumab目前正在接受針對其他實體腫瘤的測試，包括結(jié)直腸癌和非小細胞肺癌等。

這些方法的共同之處是依賴單抗來調(diào)節(jié)患者的免疫細胞，然而由于它們在體內(nèi)的半衰期有限，這一策略需要多次輸注。隨著基因編輯能力的進步，NK細胞可以穩(wěn)定地被修飾，以調(diào)節(jié)增強NK細胞效應器功能。一個例子是抑制受體NKG2A的被遺傳破壞，這導致了接種了HLAE+腫瘤的異種移植小鼠模型中的腫瘤控制良好。

06
加強NK細胞對腫瘤的轉(zhuǎn)運

NK細胞運輸和穿透腫瘤床的能力是有效抗腫瘤免疫的關(guān)鍵先決條件。與其他免疫細胞類似，NK細胞通過TME分泌的趨化因子受體及其同源配體的動態(tài)相互作用而被引導至腫瘤部位。近年來，越來越多的工作研究了如何利用這些相互作用的調(diào)節(jié)來增強對腫瘤的有效歸巢。

早期的研究集中在擴增誘導的趨化因子受體以及瞬時轉(zhuǎn)染法，但由于內(nèi)化和降解導致趨化因子表達的迅速喪失。這使得研究者通過采用基因工程策略來穩(wěn)定地為NK細胞配備異位趨化因子受體，如CXCR2、CXCR4等。目前的臨床前數(shù)據(jù)支持趨化因子受體調(diào)節(jié)可以促進NK細胞在多種難以治療的腫瘤中的轉(zhuǎn)移，包括多發(fā)性骨髓瘤，膠質(zhì)母細胞瘤，腎細胞癌，胰腺導管腺癌和卵巢癌等。

小結(jié)

隨著創(chuàng)新藥物策略的加速發(fā)展和下一代技術(shù)的出現(xiàn)，各種NK細胞產(chǎn)品被設計用于癌癥治療。隨著該領(lǐng)域的進展，闡明決定NK細胞效力和持久性的關(guān)鍵參數(shù)將是重要的，這將有利于我們優(yōu)化和設計下一代基于NK的治療藥物。

參考文獻

1.Natural killer cells in antitumour adoptive cell immunotherapy.

2.A trispecific killer engager molecule against CLEC12A effectively induces NK-cell mediated killing of AML cells.

3.Pluripotent stem cell-derived NK cells with high-affinity noncleavable CD16a mediate improved antitumor activity.